来自英国剑桥大学以及美国加州大学旧金山分校的争论团队开垦了美商凯丽一个高通量主动化过程，构建了大面积空间转录组（Large-area Spatial Transcriptomic, LaST）图谱管道，也许原位定量单细胞基因的表达。经过挑选候选基因，并运用scRNA-seq以及空间重修分解阐明了哺乳动物大脑皮层中生存星形胶质细胞分层。该文章正在2020年3月宣布于Nature Neuroscience，以下是Calerie文章的精细解读。
文章题目：Astrocyte Layers in the Mammalian Cerebral Cortex Revealed by a Single-Cell in situ Transcriptomic Map
宣布时光：2020-03-16
宣布期刊：Nature Neuroscience
主要争论团队：英国剑桥大学、美国加州大学旧金山分校等
作用因子：20.071
争论背景
星形胶质细胞（astrocytes）是核心神经系统（central nervous system, CNS）中胶质细胞的一种。它们与神经元、其他胶质细胞以及血管细胞等多种细胞彼此影响，支柱核心神经系统组织、营养、血流调治、血脑屏蔽、突触变成以及震动，并与许多脑部疾病相关。
永恒以后，许多神经生物学家以为星形胶质细胞仅仅起支柱神经元影响的次级细胞，与神经元正在大脑中的异质性分歧，星形胶质细胞是同质性的。但连年来随着神经分子生物学、神经电生理学以及神经印象等本领的繁华，迷信家们结束从新评介胶质细胞的功能，提出了星形胶质细胞异质性或多态性的新概念，但皮层组织面前的神经胶质空间构造的准确分子性格仍没有领会。
争论政策
争论人员分析运用单分子荧光原位杂交（smFISH）、RNA原位杂交（RNAScope）、免疫组化学（Immunohistochemistry，IHC）、加紧共聚焦成像本领,和小鼠全脑规范冰冻切片的细胞宰割以及定量分解，开垦了一种高通量主动化挑选哺乳动物大脑华夏位单细胞基因表达的方式，并利用P14小鼠的大脑皮层验证了本领的切实性。利用Aldh1L1-GFP转基因小鼠的大脑皮层分解皮质星形胶质细胞的分层基因表达性格；经过scRNA-seq本领检测了皮质星形胶质细胞的分子异质性，并用Louvain方式施行聚类分解，正在P56小鼠皮质中审定出两种主要的星形胶质细胞亚型。最终，运用贝叶斯模子施行空间重修露出了星形胶质细胞分层。
争论结果
1. 构建LaST图谱管道并验证其切实性
争论人员分析运用smFISH、RNAScope、IHC、加紧共聚焦成像，和小鼠全脑规范冰冻切片的细胞宰割以及定量分解，开垦了一条大容量的管道，即LaSTmap管道（图1A）。
为了验证LaST图谱管道的切实性，争论人员取P14小鼠整体大脑皮层10张前后切片施行主动六色成像（图1B~1H），全体有2,216个视野以及25 h内陆续收罗约300,000张图像，检测每层尤其性神经元的基因表达，并用每层已知符号基因的神经元（L2~4 Cux2、L4 Rorb、L5~6 Bcl11b、L6 Foxp2）施行验证。了局再现，LaSTmap管道恐怕确切判别已知层尤其性单细胞，决定层尤其性神经元基因的表达，且拥有很强的可反复性。
图1 LaST图谱管道过程及原位绘制的皮层神经元亚型
2. 皮质灰质星形胶质细胞的分层基因表达性格
灰质星形胶质细胞正在L2~5是分子均一依然宰割成多个分歧的层？争论人员猎取了2周龄Aldh1L1-GFP转基因小鼠大脑皮层，席卷体感皮层的下层（L2~4）以及深层（L5~6），并对于经流式细胞荧光分选本领 （FACS）分选的星形胶质细胞施行了RNA-seq分解（图2A），发明星形胶质细胞的记号物（Aldh1L1）正在GFP阴性细胞中高度富集，而没有是预期的富集正在GFP阳性细胞或整体皮层，且大普遍层神经元记号基因正在皮质星形胶质细胞中没有表达。
争论人员阐明灰质星形胶质细胞没有是分子均一，并决定了159个候选基因，这些候选基因正在下层以及深层的星形胶质细胞拥有分歧的表达（图2B）。
接着，争论人员运用smFISH本领追寻星形胶质细胞的尤其性基因，检测了星形胶质细胞（Aldh11l、AldoC、Glast）、神经元（Syt1、NeuN）、少突胶质细胞（Pdgfrα、Plp）、小胶质细胞（Tmem119）以及内皮细胞（Tie1）的符号物。
了局再现，Glast mRNA主要凑集正在星形胶质细胞中表达，决定了星形胶质细胞的尤其性基因（图2C~2G）。
最终，争论人员从皮质层以及星形胶质细胞尤其性分裂富集基因落选择前46个基因（图2H），根据原位定量的了局，发明骨样式产生蛋白拮抗剂Chordin-like1（Chrdl1）正在L2~4层星形胶质细胞中表达，而白细胞介素33（IL33）富集正在L5~6层星形胶质细胞中；上皮角化包膜的组成全体Sciellin（Scel）正在中层（~L4）星形胶质细胞表达，而转录克制因子Id1以及Id3侵夺了深层（L5~6）以及边缘层（L1）。这些发明说明，灰质星形胶质细胞展现出空间分层的基因表达异质性。
图2 经过RNA-seq以及LaST露出灰质星形胶质细胞之间新的层基因表达分裂
3. 星形胶质细胞层与神经元分层的联系
为了决定星形胶质细胞层与高兴性神经元是否统一，争论人员直接正在原位较为P14躯体觉得barrel皮质中8个顶层星形胶质细胞符号物与细胞层神经元符号物的空间表达模式，发明星形胶质细胞层基因常常分为浅层、中层以及深层3个空间区域。个中Chrld1、Scel、Eogt、Spry1、Paqr6以及IL33的表达越过了多个神经元分层（图3A~3D）。Chrdl1表达正在L2~4层中到达峰值，正在L1以及L5层中则较低。Scel表达正在L4~5层中最高，正在L2~3层中部则有一个下限。IL33表达正在L5层中到达峰值，正在L4以及L6层中处于低水平。这种表达犹如与分歧层次间星形胶质细胞巨细或Glast表达水平没有直接相干性。
Gfap、Id1以及Id3正在L1层灰质星形胶质细胞以及白质中都有表达，而L5-6层灰质星形胶质细胞富含IL33，但白质中没有生存，说明深层星形胶质细胞的性格分歧于白质。
总之，星形胶质细胞跨皮质灰质分为多层，并且神经胶质分层与典范神经元分层分歧（图3E）。其余，这种模式从P14结束就很分明，不断延续到成年，并遗失于人类皮层中。
图3 星形胶质细胞正在整体大脑皮层中均展现出较精深的表达梯度，且分歧于神经元的分层
4. 单细胞转录组数据露出星形胶质细胞分层
为了独立验证星形胶质细胞分层，争论人员经过scRNA-seq检测了皮质星形胶质细胞的分子异质性（图4A）。用Louvain方式施行聚类分解，正在P56小鼠皮质中审定出两种主要的星形胶质细胞亚型，不同定名为AST2以及AST3，不同经过Unc13c以及Agt的表达来识别（图4C），并发明它们正在整体皮质层中大度稠浊。争论人员进一步正在scRNA-seq数据中检测了基数层星形胶质细胞符号物的表达模式，发明正在单个星形胶质细胞转录组数据中层星形胶质细胞符号物正在细胞亚群中表达，但没有以聚类相干的办法表达（图4D）。以上说明，皮质中大概生存多个星形胶质细胞异质性轴（即层状以及非层状）。
为了判断正在scRNA-seq中分解的皮质细胞层位置，争论人员利用贝叶斯模子施行空间重修，并经过scRNA-seq的聚类分解（图4B），审定出两种皮质星形胶质细胞亚型位于多个分层，这与它们正在空间上彼此混杂的查看了局相统一。利用代替SC3方式衍生的scRNA-seq簇再现出一致的非层尤其性散布。
综上，皮质中星形胶质细胞再现出至多两个分子异质性轴：
1）经过scRNA-seq数据的无监视聚类检测到的层独立的异质性；
2）基于smFISH以及scRNA-seq数据的空间重修再现出的层依附的异质性。
为了扩张星形胶质细胞层符号物的遗失库，争论人员施行单细胞转录组的空间重修，失去125个拥有层相干表达性格的基因。层相干星形胶质细胞候选基因平衡占每个细胞19%的转录本以及8%的表达基因；个中，2/3被预计展现出下层以及深层星形胶质细胞的表达（一致于Chrdl1以及Il33），而另外1/3的基因展现出白质样层表达谱（一致于Id3；图4G）。争论人员运用smFISH施行全体验证，如图4H~J所示，转录调控因子核蛋白1（Nupr1）正在L2~4星形胶质细胞中表达最高，而环氧化物水解酶2（Ephx2）以及蛋白脂质神经蛋白（Nnat）正在L5~6深层星形胶质细胞中表达较高。
图4 根据单细胞转录组数据对于星形胶质细胞分层施行空间重修
5. 神经元的崩溃直接或间接确定星形胶质细胞层状基因表达
为了争论神经元因子是否调治星形胶质细胞层构造，争论人员将P14小鼠条件性敲除Satb2（与向导神经元有丝散乱前期相干的基因）（Satb2 cKO小鼠），发明正在Satb2 cKO小鼠中L4神经元（Rorb，Pamr1）没有生存，而 L2~3神经元再现一些异位深层基因表达（Bcl11b；图5A、5C）。所以，争论人员发明星形胶质细胞中Scel表达全面缺失，而下层星形胶质细胞基因Chrdl1以及Eogt昭著升高（图5B、5D），深层星形胶质细胞基因（Il33、Id1、Id3）没有受作用。这些发明说明，有丝散乱后L4尤其性神经元身份对付表层星形胶质细胞身份的孕育是须要的。
接着，争论人员运用Reeler（Reln）小鼠（Reeler是与向导神经元有丝散乱前期相干的基因）评估与神经元相干的深层星形胶质细胞个性。正在Reln小鼠中，高兴性神经元被正确指定，但未能迁徙到其妥善的层，正在出身前孕育“由内而外”的皮层。与预料的一律，正在P14，表层（Cux2）以及深层层状符号物（Bcl11b、Foxp2）的表达模式被回转，而L4神经元（Rorb）正在皮层深度变成极度簇（图5E~5G）。其余，争论人员发明表层以及深层星形胶质细胞层是倒置的。与L4神经元表型统一，Scel阴性星形胶质细胞极度地定位于皮质深度。总之，以上了局说明，皮质神经元记号到场了星形胶质细胞层发育的调治（图5I）。
图5 有丝散乱后神经元启发建立星形胶质细胞分层的证明
6. 星形胶质细胞层性格因皮质区域而异
争论人员量化P14小鼠皮层顶层星形胶质细胞符号的模式，以争论星形胶质细胞的散布。如图6所示，星形胶质细胞层基因表达正在背腹侧以及前尾侧皮质中昭著改变。Scel基因的表达正在体感区域L4~5星形胶质细胞中富集，但正在内侧静止以及尾部视觉皮层缺失（图6A、6B），这种模式与L4神经元出色相干（图6D）。正在另一种分歧的模式下，Chrdl1正在整体皮层的L1~4星形胶质细胞中再现出背腹侧富集（图6C），而深层星形胶质细胞记号物表达正在背腹轴的内侧以及外侧区域富集（Il33、Id3）。所以，星形胶质细胞正在整体皮层中展现出层状以及区域异质性。总之，以上了局说明，神经胶质层是皮质层以及区域组织的根底生物记号物性格。
图6 星形胶质细胞分层性格正在各皮质区域之间生存改变
结论
LaSTmap也许算作一种弱小的本领来验证单细胞基因的原位表达，并发明了说明细胞各类性的配合模式。争论人员贯串LaSTmap，发明星形胶质细胞的细胞层模式分歧于高兴性神经元，是一种拥有更高阶繁复性的复合“神经胶质”皮质组织。这一发明从新定义了咱们对于哺乳动物大脑组织的管见，露出了星形胶质细胞皮质层的符号物，为领会发育以及/或疾病中的寻常功能供给了新见解。
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